Muzeum Karlova mostu v několika sálech původního špitálu Křížovníků a kostela sv. Františka přibližuje návštěvníkům v mnoha rovinách zejména mostní stavitelství a vše, co s ním souvisí. Mapuje historii spojení obou pražských břehů. K vidění jsou kamenné stavební prvky mostní architektury, původní řemeslnické nástroje, rekonstrukce dobových stavebních strojů, rekonstrukce založení mostního pilíře v měřítku 1:2.
Naleznete zde model Prahy kolem roku 1000 s vyznačenými brody přes Vltavu, které tehdy představovaly zásadní komunikační spojnice. V expozici jsou představeny také sochy ze Staroměstské mostecké věže. Jedná se o odlitky z forem pořízených v 19. století, ještě se zachovalou povrchovou modelací, dříve než byla zásadně poškozena znečištěným ovzduším. Jistou specialitu představuje bozzetto Jana Nepomuckého – původní skicu k první skutečné plastice pořízené pro most na konci 17. století.
V rámci muzea je zpřístupněna také podzemní část křížovnického kostela. Její dnešní barokní podoba, dílo francouzského architekta Jeana Baptisty Matheye (čti Žána Batysty Mateje) s barokní grottou z konce 17. století, ukrývá základy původního gotického kostelíku, jehož základní kámen položila 1252 sama Anežka Přemyslovna, zakladatelka Řádu křížovníků s červenou hvězdou.
Součástí základní koncepce muzea je i pořádání aktuálních krátkodobých výstav spojených tématicky s Karlovým mostem.